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Sep 10, 2023

Bußgeld

Parasiten und Vektoren

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 186 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Das Ross-River-Virus (RRV) ist Australiens häufigstes und am weitesten verbreitetes durch Mücken übertragenes Arbovirus und stellt ein erhebliches Problem für die öffentliche Gesundheit dar. Angesichts der zunehmenden anthropogenen Auswirkungen auf Wildtiere und Mückenpopulationen ist es wichtig, dass wir verstehen, wie RRV in seinen endemischen Hotspots zirkuliert, um zu bestimmen, wohin öffentliche Gesundheitsbemühungen gerichtet werden sollten. Aktuelle Überwachungsmethoden sind bei der Lokalisierung des Virus wirksam, liefern jedoch keine Daten über die Verbreitung des Virus und seiner Stämme in der Umwelt. Diese Studie untersuchte die Fähigkeit, Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) innerhalb der variablen E2/E3-Region zu identifizieren, indem Haplotypen voller Länge aus einer Reihe von aus Mückenfallen gewonnenen Proben generiert wurden.

Ein neuartiger Arbeitsablauf zur Amplifikation gekachelter Primer zur Amplifikation von RRV wurde mit Analyse unter Verwendung von MinION von Oxford Nanopore Technology und einem benutzerdefinierten ARTIC/InterARTIC-Bioinformatikprotokoll entwickelt. Durch die Schaffung einer Reihe von Amplikons im gesamten Genom wurde eine SNP-Analyse im Feinmaßstab ermöglicht, indem gezielt auf die variable Region abgezielt wurde, die als einzelnes Fragment amplifiziert wurde, und Haplotypen etabliert wurden, die die räumlich-zeitliche Variation von RRV am Untersuchungsort in Victoria beeinflussten.

Eine Bioinformatik- und Laborpipeline wurde erfolgreich für Homogenate ganzer Mückenfallen entworfen und implementiert. Die resultierenden Daten zeigten, dass die Genotypisierung in Echtzeit durchgeführt werden konnte und dass der gesamte Fallenkonsens der Viren (mit den wichtigsten SNPs) zeitnah bestimmt werden konnte. Kleinere Varianten wurden erfolgreich aus der variablen E2/E3-Region von RRV nachgewiesen, was die Bestimmung des Haplotyps in komplexen Mückenhomogenatproben ermöglichte.

Die hier entwickelten neuartigen bioinformatischen und Nasslabormethoden werden eine schnelle Erkennung und Charakterisierung von RRV-Isolaten ermöglichen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Konzepte sind auf andere Viren übertragbar, die als Quasispezies in Proben existieren. Die Fähigkeit, kleinere SNPs und damit Haplotyp-Stämme zu erkennen, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Epidemiologie von Viren in ihrer natürlichen Umgebung.

Das Ross-River-Virus (RRV) (Gattung Alphavirus, Familie Togaviridae) ist ein von Mücken übertragenes Arbovirus, das in Australien endemisch ist und auch in Papua-Neuguinea und auf den Südpazifikinseln nachgewiesen wird [1]. RRV kann beim Menschen Polyarthritis verursachen, eine schwächende Form der Arthritis, die das Potenzial hat, langanhaltende Gesundheitsprobleme zu verursachen [1]. RRV zeigt beim Menschen auch Symptome wie Fieber, Hautausschlag und Müdigkeit [1]. Klinische Symptome bei Pferden wurden ebenfalls berichtet [2] und sie wurden als Verstärker des Virus in Betracht gezogen [3]. Die wichtigsten Mückenüberträger des Virus in Australien sind Aedes camptorhynchus, Ae. vigilax, Culex annulirostris [4] und Ae. notoscriptus [5]. Makropoden gelten als Hauptreservoirwirte, aber auch andere plazentare Säugetiere und Vögel könnten als Reservoir fungieren [6]. Die Übertragung des Virus erfolgt durch den Stich einer weiblichen Mücke, und gelegentlich kann eine infizierte weibliche Mücke das Virus vertikal auf ihre Eier übertragen, was als transovarielle Übertragung bezeichnet wird [7,8,9]. Die Ausbreitung menschlicher Populationen in Mückenlebensräume erhöht die Interaktionen zwischen Mensch und Mücke [10,11,12] und erhöht das Risiko für den Menschen, von Arboviren (einschließlich RRV) befallen zu werden [13]. Dieser weltweite Trend wird voraussichtlich zunehmen [14, 15], und die Überwachung von durch Mücken übertragenen Viren ist daher zur Unterstützung der öffentlichen Gesundheit unerlässlich.

RRV wurde erstmals 1958 in der Nähe von Townsville im hohen Norden von Queensland, Australien, entdeckt, wobei das älteste Isolat (T48) als G1 klassifiziert wurde [16]. Es gibt vier Hauptgenotypen von RRV, wobei G3 und G4 direkte Nachkommen von G1 sind und G2 eine eigene, getrennte Gruppe darstellt [17, 18]. Jeder dieser Genotypen bewohnt entweder derzeit bestimmte Regionen Australiens oder hat diese in der Vergangenheit besiedelt. Obwohl G1 und G2 offenbar nicht mehr im Umlauf sind, wurden sie in den Jahren vor 2000 häufig in Queensland und Westaustralien gefunden [19]. G3, ein weiterer historischer Genotyp, kam in den späten 1970er und frühen 1980er Jahren überwiegend auf den Cookinseln vor [19]. Einige G3-Sequenzen wurden bis in die frühen 2000er Jahre in verschiedenen australischen Bundesstaaten beobachtet, wobei der jüngste Nachweis ein Isolat aus Tasmanien aus dem Jahr 2014 war. Diese drei Genotypen wurden größtenteils durch den derzeit am häufigsten verbreiteten Genotyp G4 ersetzt. Der G4-Stamm von RRV ist in Sublinien unterteilt, die durch Nukleotidähnlichkeitsanalysen bestimmt werden [19]. Die G4-Unterlinien mit den Namen G4A, G4B, G4C und G4D wurden in Westaustralien, Victoria, Queensland, New South Wales, Papua-Neuguinea und dem Northern Territory gemeldet, wobei die jüngsten Isolate (2018) G4B und G4A zugeordnet wurden Unterlinien [19].

RNA-Viren wie RRV mutieren schnell, da der 3'-Exonuklease-Korrekturlesemechanismus ihrer RNA-abhängigen RNA-Polymerase fehlt [20,21,22]. Die Exonukleaseaktivität des Polymeraseenzyms spielt eine wichtige Rolle bei der Nukleinsäurereplikation, wobei bei Erkennung einer falsch eingebauten Base die Richtung der Polymerase umgekehrt und die falsche Base entfernt wird. RNA-Viren fehlt diese Aktivität und daher verbleiben alle falsch eingebauten Basen in der Nukleinsäuresequenz, was zu einer höheren Mutationsrate bei RNA-Viren im Vergleich zu anderen Organismen führt, obwohl einige Mutationen schädliche Mutationen zur Folge haben [23, 24]. Hochvariable Regionen, einschließlich jener Nukleotidsequenzen, die Hüll-Glykoproteine ​​kodieren und mit Wirtszellrezeptoren interagieren, werden häufig zur Charakterisierung viraler Varianten einschließlich RRV verwendet [19, 25, 26]. Bei RRV sind die E2/E3-Regionen, die für Oberflächenrezeptor-Glykoproteine ​​kodieren, eine häufig verwendete Region für molekulare epidemiologische Studien (19, 27, 28). In viralen Glykoproteinen werden häufig höhere Mutationsraten beobachtet, wobei Aminosäureveränderungen in diesen Regionen mit einem Anstieg der Übertragungsraten bei Arboviren wie Chikungunya- und West-Nil-Virus verbunden sind [29].

Die Gesamtgenomsequenzierung (WGS) bietet die Möglichkeit, die Variation eines Zielgenoms innerhalb einer Probe in komplexen Umweltproben, wie z. B. ganzen Mückenfallen, zu bewerten. Der RAMPART-Workflow des ARTIC-Netzwerks (30) ist eine WGS-basierte Pipeline, die in molekularepidemiologischen Studien zum Ebola-Virus-Ausbruch 2014–2016 in Westafrika (31) und anschließend für die Zika-Virus-Pandemie in verwendet wurde Südamerika [30], Poliovirus [32] und SARS-CoV-2 [33]. Das ARTIC-Netzwerk verwendet einen gezielten Ansatz, der gekachelte PCR-Amplifikation und RAMPART für eine Echtzeit-Referenzkartierung nutzt, um das in der Probe vorhandene Virus zu identifizieren [30, 34]. RAMPART ist ein End-to-End-Analysesystem, das häufig verwendete Programme (minimap2 [35] und Porechop [36]) in eine benutzerfreundliche Benutzeroberfläche integriert und es dem Benutzer ermöglicht, Oxford Nanopore MinION-Sequenzierungsläufe in Echtzeit zu überwachen. Die kommentierten Lesevorgänge von RAMPART können dann weiterverarbeitet werden. Derzeit kann die Nachanalyse für RAMPART über die InterARTIC GUI ausgeführt werden [37]. Diese Pipeline kombiniert unter anderem BCFtools [38], Medaka [39], Nanopolish [40] und Minimap2 [35], um aus Nanopore-Daten SNPs namens virale Genome zu generieren.

In dieser Studie haben wir InterARTIC- und RAMPART-Workflows für RRV angepasst und auf vor Ort gesammelte Mücken aus Arbovirus-Überwachungsfallen angewendet, die zur Viruserkennung homogenisiert wurden. Darüber hinaus identifizierten wir SNPs innerhalb einer signifikanten variablen Region von RRV und ordneten virale Haplotypen zu, um die virale Ökologie in der Gippsland Lakes-Region von Victoria zu informieren.

In dieser Studie verwendete RRV-positive Mücken-Ganzfallen-Mahlhomogenate und aus RRV-Zellkulturen gewonnene Isolate sind in Tabelle 1 aufgeführt. Eine Aufschlüsselung der Mückenarten für Fallen, sofern verfügbar, wird bereitgestellt (siehe Zusatzdatei 1). Ganze Mückenfallenmahlungen wurden aus Mückensammlungen über Nacht an Probenahmestellen in Abb. 1 unter Verwendung zuvor beschriebener Methoden (41) und aus Zellkulturen gewonnener Isolate (42) hergestellt.

Karte der landwirtschaftlichen Probenahmestellen für Victoria-Mücken in Gippsland, Victoria. Die Karte zeigt Probenahmestellen von 2019 bis 2022, die in dieser Studie verwendet wurden. Karten abgeleitet von der Google Maps-Website

Um das Vorhandensein von RRV zu bestätigen und die relative Menge an genomischer RRV-Nukleinsäure in einer Mückenhomogenatfallenprobe (unter Verwendung des CT-Werts) zu bestimmen, wurde ein RRV RT-qPCR-spezifischer Assay auf extrahierte RNA-Proben angewendet. Dieser Assay zielt auf das E2-Gen ab und produziert ein Amplikon von 67 bp. RT-qPCR wurde mit den extrahierten RNA-Proben wie berichtet durchgeführt [42,43,44].

Primer wurden für das Tiling-Amplikon-Schema mithilfe des Online-Portals PrimalScheme [30] entworfen. Elf Sequenzen des gesamten Genoms wurden ausgewählt und als Referenz auf PrimalScheme hochgeladen (Tabelle 2); Es gab Vertreter der vier verschiedenen RRV-Genotypen, darunter die Genotypen G4A und G4B, die kürzlich in Victoria entdeckt wurden, sowie die historischen Genotypen (G2 und G1).

Die ARBO012-Sequenz (G4B, MW489504) wurde als Referenz für PrimalScheme festgelegt, um eine zeitgenössische RRV-Sequenz aus Wellington Shire, Victoria, Australien darzustellen. Die Amplikonlänge wurde auf 1500 bp eingestellt, ohne dass die Optionen „High GC“ oder „Pinned“ ausgewählt waren. Die von PrimalScheme ausgegebene Primersequenz wurde dann von IDT (Integrated DNA Technologies, IA, USA) als Oligonukleotide mit insgesamt neun Primerpaaren synthetisiert, die jeweils 1500 bp lange überlappende Amplifikate erzeugten (Tabelle 3). Die variable E2/E3-Region von RRV wurde in einem einzelnen Amplikon (Primerpaar 7) für die anschließende SNP- und Intra-Trap-Virusdiversitätsanalyse erfasst. Die Primer wurden auf eine Konzentration von 100 µM mit zwei Primerpools, „gerade“ und „ungerade“, resuspendiert, die für die Kachelanwendung gemäß den Methoden des ARTIC-Netzwerks vorbereitet wurden [45]. In jedem der beiden Primer-Pools betrug die Konzentration der einzelnen Primer 0,015 µM pro Primer, mit einer endgültigen Gesamtkonzentration des Pools von 100 µM. Diese wurde dann zu einer Arbeitslösung von 10 µM verdünnt und in den folgenden PCR-Amplifikationsreaktionen verwendet.

Virale RNA wurde aus Mücken-Ganzfallen-Mahlhomogenaten (Tabelle 1) und aus RRV-Material aus Zellkulturen extrahiert, das als Positivkontrolle verwendet wurde (42). Fünfzig Mikroliter RRV-infizierte Zellkultur und Mücken-Ganzfallen-Mahlhomogenate wurden mit einem Standard-MagMax™ Viral RNA Isolationsvorbereitungskit auf dem MagMax™ 24 Express-Prozessor (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) verarbeitet. Für jeweils 50 µl Trap-Grind-Homogenat oder Viruszellkultur wurden 65 µl Lysepuffer mit 1 µl RNA-Träger, 65 µl 100 % Isopropanol, 10 µl RNA-Kügelchen und 10 µl RNA-Enhancer gemischt, die im MagMax™-Kit enthalten sind. Es wurden jeweils zwei Runden der Waschgänge eins und zwei verwendet (jeweils 150 µl). Die Endextraktion wurde in 50 µl Elutionspuffer eluiert.

Die cDNA-Synthese wurde an der extrahierten RNA unter Verwendung von 2 µl 5X LunaScript RT SuperMix (New England Biolabs, MA, USA), das zufällige Hexamere enthält, durchgeführt und mit 8 µl der extrahierten RNA kombiniert und bei 25 °C inkubiert 2 Min., 10 Min. bei 55 °C, gefolgt von einer abschließenden Inkubation bei 95 °C für 1 Min. Die cDNA wurde bei 4 °C aufbewahrt, bis sie zur gezielten Anreicherung von RRV mithilfe des gekachelten Amplifikationsschemas für das gesamte Genom verwendet wurde.

Aus den Mücken-Ganzfallen-Mahlhomogenaten gewonnene cDNA wurde auf der Grundlage der Midnight-1200-kb-Amplifikationsmethode [46] mit größeren Modifikationen PCR-amplifiziert. Für jede Probe wurden zwei Reaktionen vorbereitet („ungerade“ und „gerade“, Tabelle 3). Jede Reaktion enthielt 2,5 µl Template-cDNA, 9,6 µl nukleasefreies Wasser, 0,40 µl eines der 100 µM Primerpools und 12,5 µl Q5 Hot Start Hi-Fi 2X Mastermix (New England BioLabs, MA, USA) und war PCR amplifiziert unter den folgenden Bedingungen: 98 °C für 30 s und 40 Zyklen von 98 °C für 15 s mit 65 °C für 7 min zur Anreicherung von RRV.

Die Amplifikate wurden mit einer Kombination aus der GunIt-Methode [45] und der LoCost-Methode [47] mit Modifikationen sequenziert. Die 24 einzelnen PCR-Reaktionen (zwei PCR-Kachelreaktionen pro Mückenhomogenatprobe) wurden kombiniert und in 12 50-µl-Pools verdünnt, die 2,5 µl jeder PCR-Kachelreaktion pro Probe und 45 µl nukleasefreies Wasser enthielten. Für jede der 12 gepoolten PCR-Reaktionen werden 7,5 µl des entsprechenden verdünnten PCR-Produkts, 5 µl nukleasefreies Wasser, 1,75 µl Ultra End II Prep Reaction Buffer (New England BioLabs, MA, USA) und 0,75 µl Ultra End II Prep verwendet Enzymmischungen (New England BioLabs) wurden kombiniert und 15 Minuten bei Raumtemperatur, 15 Minuten bei 65 °C und 1 Minute auf Eis inkubiert.

Um Barcode-Proben für die Sequenzierung zu generieren, wurden 4,2 µl der PCR-Kachelvorlage mit 3 µl Wasser, 2,5 µl des NB-Barcodes (SQK-LSK109 und EXP-NBD104, Oxford Nanopore Technologies, UK) und 10 µl Blunt/TA Ligase Master kombiniert Mischung (New England BioLabs) und 3 µl Wasser. Die Mischung wurde 20 Minuten bei Raumtemperatur, 10 Minuten bei 65 °C und 1 Minute auf Eis inkubiert.

Zwanzig Mikroliter der mit Barcodes versehenen Reaktionen wurden gepoolt, um die endgültige Bibliothek für die Sequenzierung zu bilden, und mit ProNex-Kügelchen (Promega, WI, USA) in der 0,7-fachen Menge des gepoolten Volumens (168 µl Kügelchen) kombiniert. Die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert und der Überstand entfernt, sobald er klar war. Die Perlen wurden zweimal durch Resuspendieren in 250 µl Short Fragment Buffer (Oxford Nanopore Technologies, UK) gewaschen, gemischt und pelletiert und der Überstand verworfen. Die Perlen wurden dann in 200 µl 70 %igem Ethanol (Raumtemperatur) gewaschen, wobei darauf geachtet wurde, das Pellet nicht zu zerstören. Das Ethanol wurde entfernt und das Pellet etwa 1 Minute lang oder bis es glänzte, getrocknet. Das Pellet wurde in 31 µl Elutionspuffer (Oxford Nanopore Technologies) resuspendiert, 2 Minuten lang inkubiert und in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen überführt, wodurch die Nukleinsäurebibliothek für die Sequenzierung entstand. Ein 1-µl-Aliquot der Bibliothek wurde auf Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, MA, USA) unter Verwendung eines dsDNA High Sensitivity Kit quantifiziert.

Zur Ligation von Sequenzierungsadaptern an die Barcode-Proben wurde die Gesamtmenge der am Ende reparierten MinION-Bibliothek (30 µl) mit 10 µl des NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer (5×), 5 µl Adapter Mix (AMII) und 5 µl kombiniert Schnelle T4-DNA-Ligase und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. ProNex-Kügelchen wurden in einem Verhältnis von 0,7 × dem Bibliotheksvolumen zu der obigen Mischung (35 µl Kügelchen) hinzugefügt und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, wobei der Überstand entfernt wurde, wenn er klar war. Die pelletierten Perlen wurden mit 250 µl Short Fragment Buffer (Oxford Nanopore Technologies, UK) gewaschen; der Überstand wurde entfernt und erneut gewaschen. Das Pellet wurde in 13 µl Elutionspuffer (Oxford Nanopore Technologies) resuspendiert, 2 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und das Eluat zur Sequenzierung gesammelt. Ein Mikroliter der endgültigen Sequenzadapter-ligierten Bibliothek wurde auf einem Qubit unter Verwendung des dsDNA-Kits quantifiziert.

Die eluierte Probe wurde dann gemäß den standardmäßigen MinION-Lade- und Sequenzierungsverfahren (Genomic DNA by Ligation, Version GDE_9063_v109_revAJ_14Aug2019) auf eine vorbereitete MinION-Durchflusszelle geladen.

Sowohl RAMPART [34] als auch InterARTIC [37] wurden für die Verwendung mit RRV gemäß den Anweisungen auf den jeweiligen GitHub-Seiten modifiziert. Für diese Studie wurden Primerdateien generiert (1500-bp-Amplikonsatz) sowie die RRV-Referenzsequenz, die mit Anmerkungen versehen und in die Datei primer.json geladen wurde, damit RAMPART sie nutzen kann. Eine Reihe von RRV-Genomen, die alle Genotypen abdecken, einschließlich vorhandener Viren (G1 und G2), wurde außerdem in die Datei „references.fasta“ geladen, damit RAMPART Referenzkartierungsschritte durchführen kann.

RAMPART wurde verwendet, um den Fortschritt der MinION-Sequenzierung zu überwachen, zunächst um alle gemischten genotypischen Proben zu identifizieren und die Proben durch Referenzzuordnung zurück zur Datei references.fasta zu genotypisieren.

Um Daten über ganze Mückenfallenproben hinweg zu vergleichen, mussten alle generierten Konsenssequenzen normalisiert werden. Um mögliche Verzerrungen gegenüber Genotypen in der Referenzkartierungsphase zu reduzieren, wurde eine generische Konsens-RRV-Sequenz erstellt. Der Konsens wurde unter Verwendung von 123 Teil- und Vollgenomen erstellt, die von NCBI heruntergeladen wurden (siehe Zusatzdatei 2). Alle Sequenzen wurden in Geneious (V11.0.11) geladen und mit dem MUSCLE-Algorithmus abgeglichen. Anschließend wurden die Sequenzen sowohl am 5′- als auch am 3′-Ende auf das kürzeste Genom zugeschnitten. Der Konsens der gekürzten Genomsequenzen (Länge 11.296 nt) wurde exportiert und als Referenz für alle folgenden Analysen verwendet (im Folgenden als „RRV-Referenzsequenz“ bezeichnet). Die für die Feinanalyse verwendete E2/E3-Region des RRV-Genoms entsprach den Nukleotiden 8222–9743 dieser Referenzsequenz.

Die InterARTIC-Nanopolish-Pipeline wurde an den Homogenatproben der gesamten Mückenfalle (nach 24 Stunden MinION-Sequenzierung) unter Verwendung der durch die Option „Benutzerdefiniertes Virus“ definierten Parameter ausgeführt. Die resultierende BAM-Datei wurde für die Weiterverarbeitung verwendet. Für die Analyse der gesamten Genomsequenz wurden nur Proben von Mückenhomogenatfallen verwendet, die alle neun Amplikons erzeugten. Mückenhomogenatfallenproben, die das siebte Amplifikat erzeugten, das der E2/E3-Region des RRV-Genoms entspricht, wurden für kleinere SNP-Analysen und Haplotypanalysen verwendet.

Die BAM-Datei wurde mit dem folgenden BCFtools-Befehl [38] (V 1.14-GCC-11.2.0) für die Generierung des gesamten Genoms ausgeführt [bcftools mpileup -a INFO/AD -O u -d 10.000 -L 9000 -f reference.fasta sortiert /bam/from/nanopolish.sorted.bam| bcftools call -mv -O u | bcftools norm -O u -f reference.fasta | bcftools filter -O u -i'%QUAL > 180' | bcftools view -O v -i "(INFO/AD[1]/INFO/DP) > 0,45" > barcode.vcf | bcftools Konsens barcode.vcf > barcode_consensus.fasta]. Die resultierende Gesamtgenom-Konsensussequenz jeder einzelnen Mückenhomogenatfallenprobe wurde in der phylogenetischen Analyse verwendet.

Eine phylogenetische Maximum-Likelihood-Analyse (ML) wurde durchgeführt unter Verwendung von (i) Gesamtgenom-Konsensussequenzen, die von NCBI gesammelt wurden, (ii) Sequenzen, die aus den 16 RRV-positiven Gesamtfallen-Mückenfallen-Grinds generiert wurden, (iii) zwei Positivkontrollen (ARBO012-MinION01 und ARBO012-MinION02; Tabelle 2) und (iv) Sequenzen, die in einer früheren RRV-Studie enthalten waren [19]. Der ML-Baum wurde von MEGA11 [48] nach Ausrichtung mit MAFFT [49] unter Verwendung des General Time Reversable-Moduls in MEGA11 und einem Bootstrap-Wert von 1000 generiert.

Die Sequenzanalyse der E2/E3-Region des RRV-Genoms wurde sowohl mit SAMtools [38] (1.15-GCC-11.2.0) als auch mit iVar [50] mit dem folgenden Befehl [samtools mpileup -aa -A -d 1.000.000 -B] durchgeführt -Q 0 -f reference.fasta bam/file/from/nanopolish/.sorted.bam -r NCBI:8222-9743 | ivar Varianten -p Beispielname -q 20 -t 0,03 -r reference.fasta -m 30]. Nachfolgende .tsv-Dateien wurden untersucht und alle Indels wurden entfernt, da diese für eine Feinanalyse als unzuverlässig erachtet wurden. Die verbleibenden SNPs wurden für eine Feinanalyse verwendet und über mehrere Fallen hinweg verglichen, um Konsistenz und mögliche Variationen zu untersuchen. SNPs wurden in eine CSV-Datei übertragen, wo sie dann zur manuellen Identifizierung von Haplotypen über die Fallen hinweg verwendet wurden, wobei Häufigkeiten und Nukleotidpositionen untersucht wurden. SNPs wurden mit einem niedrigeren Schwellenwert aufgerufen als bei der gesamten Genomanalyse (3 % der Lesevorgänge im Vergleich zur Standardeinstellung für BCFtools).

Die Haplotypisierung der Fallenproben erfolgte durch visuelle Inspektion der Ausrichtung, wobei besonderes Augenmerk auf kleinere SNP-Frequenzen gelegt wurde, die über die CSV-Datei identifiziert wurden. Spezifische Haplotypen für jede Falle wurden durch das Vorhandensein oder Fehlen bestimmter SNPs in der E2/E3-Region des RRV-Genoms bestimmt, bis alle SNPS aus allen Isolaten Haplotypen zugeordnet wurden. Die Lesevorgänge wurden mithilfe von IGV (Version 2.5.0 [51,52,53]) und Tablet (Version 1.21.02.08 [54]) manuell überprüft, um sicherzustellen, dass die ordnungsgemäß zugewiesenen Haplotyp-SNPs vorhanden waren. Die phylogenetische Analyse der Haplotypen wurde in MEGA11 wie oben in der WGS-Analyse beschrieben durchgeführt.

RAMPART- und InterARTIC-Analysen zeigten, dass das RRV, das in allen 20 Mückenfeldfallen-Homogenaten vorhanden war, die im Wellington Shire, Victoria, gesammelt wurden, zu einem einzigen Genotyp, G4A, gehörte. Sechzehn der Mückenfeldfallen-Homogenate erzeugten eine ausreichende Abdeckung über alle neun Amplikons (angezeigt durch das Vorhandensein aller neun Amplikons bei einer Abdeckung > 20x), um die Zusammenstellung ganzer Genomsequenzen von RRV und die anschließende phylogenetische Analyse zu ermöglichen.

Die phylogenetische Maximum-Likelihood-Analyse der 16 Konsensussequenzen des gesamten Genoms bestätigte die Clusterbildung der Proben innerhalb von G4A (Abb. 2). Zwischen 2020 und 2022 gab es keine räumlich-zeitliche Häufung der 16 analysierten genomischen Konsensussequenzen aus Wellington Shire (Abb. 2).

Phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit (ML). Phylogenetischer Baum ganzer RRV-Genome unter Verwendung eines GTR-Modells, Bootstrap 1000. Der Baum verwendet Genom-Konsensus-Nukleotidsequenzen von 16 Mückenfallen, die an sechs Standorten gesammelt wurden. In die Analyse einbezogen ist die RRV-positive Sequenzierungskontrolle (ein aus der Zellkultur gewonnenes Isolat, ARBO012), die in beiden MinION-Sequenzierungsläufen enthalten war. Sequenzen werden in ihren Genotypen durch Farbe unterschieden

Es gab keine identischen Gesamtgenomfallensequenzen von RRV zwischen den Mückenhomogenatfallen. Die vielfältigsten RRV-Gesamtgenomsequenzen befanden sich zwischen der Falle HS-22-Jan und MP-20-Mar-5, die sich im gesamten Genom um 34 Nukleotide unterschieden (0,3 % Divergenz über 11.296 nt). Die ähnlichsten RRV-Gesamtgenomsequenzen stammten von den Fallen MP-20-Mar-2 und WP-20-Mar-1, die sich im gesamten Genom nur um ein Nukleotid unterschieden (Abb. 2).

Von den 20 in dieser Studie sequenzierten Fallen erzeugten 18 ein E2/E3-Amplikon voller Länge, das für den Nachweis von SNPs mit einer Häufigkeit von > 3 % aller Lesevorgänge verwendet wurde, um eine Haplotypanalyse im Feinmaßstab zu unterstützen.

Die aus zwei Sequenzierungsläufen generierten Sequenzdaten der Positivkontrolle (ARBO012) waren beide identisch mit der zuvor generierten (Illumina-basierten) Referenzsequenz über das E2/E3-Amplikon, was darauf hinweist, dass es zwischen den Läufen keine Variation zwischen den SNP-Analysen in der variablen Region gab .

Zwanzig SNPs wurden über das 1500-bp-E2/E3-Amplikon aus 18 Fallen nachgewiesen. Sieben der 20 SNPs führten zu Aminosäureveränderungen, wobei einer der sieben SNPs ein Stoppcodon erzeugte (Abb. 3). Aus den 20 SNPs wurden zehn einzigartige Haplotypen bestimmt (Abb. 3). Phylogenetisch waren die zehn verschiedenen Haplotypen in drei verschiedenen Gruppen vertreten (mit 1–3 gekennzeichnet). Den RRV-Haplotypen fehlte jegliche räumlich-zeitliche Struktur, wobei der prominenteste Haplotyp, 2.2, in neun separaten Fallen über die drei untersuchten Jahre hinweg und an allen sechs Standorten nachgewiesen wurde (Abb. 4B, Tabelle 4). Dieser Haplotyp wurde über einen Zeitraum von 10 Monaten (zwischen April 2020 und Januar 2021; Tabelle 4) dreimal bei GB nachgewiesen. Der zweithäufigste Haplotyp war 3.1, der in sieben Fallen über ein Jahr hinweg an den Standorten MP, WP und LS nachgewiesen wurde (Abb. 4B, Tabelle 4). Dieser Haplotyp wurde bei MP im März 2020 innerhalb von 13 Tagen zweimal bei zwei verschiedenen Fangereignissen nachgewiesen. Acht Haplotypen wurden bei einem Fangereignis nur einmal gesehen (1,1 und 1,2 in HS, 3,2, 3,4 und 2,1 in MP, 3,3 in WP und 2,3 und 2,4 in GB; Abb. 4B, Tabelle 4).

Intra-Mückenfalle RRV E2/E3-Diversität und genetische Analyse verschiedener Haplotypen, die in Wellington Shire beobachtet wurden. Schematische Darstellung von Amplikon 7 (E2/E3-Region 8222–9743nt) mit allen Haplotyp-Mutationen, die aus der generischen Konsensus-RRV-Sequenz stammen. Die Haplotypen (1.1 bis 3.4) sind links aufgeführt. MEGAX wurde verwendet, um die Ausrichtung zu visualisieren und die Nukleotidbasen in Aminosäurereste zu übersetzen

Zeitliche Intra-Mückenfallen-Diversität von RRV E2/E3. Ein phylogenetischer Baum mit maximaler Wahrscheinlichkeit (ML), GTR-Modell, der 1000 der mit MEGAX generierten RRV-Haplotypen bootet. Haplotypen werden in ihren Genotypen durch die Farbe unterschieden. Alle sind Haplotypen desselben Genotyps, G4A. B Grafische Darstellung der räumlich-zeitlichen Variation des RRV E2/E3-Haplotyps. Jede Falle wird durch ein Kreisdiagramm dargestellt, wobei der Anteil und die Anzahl der Haplotypen mit entsprechenden Farben dargestellt sind. Karten abgeleitet von der Google Maps-Website

In fünf der 18 Fallen wurden gemischte Haplotypen nachgewiesen. In jeder der fünf gemischten Haplotypfallen variierte der Häufigkeitsprozentsatz kleinerer Haplotypen zwischen 0,7 und 18 %. Innerhalb von vier gemischten Fallen wurden nur zwei Haplotypen gesehen, wobei eine Falle aus GB im Jahr 2022 eine Mischung aus drei Haplotypen zeigte. Der SNP, der zum Stoppcodon führte, war im Haplotyp 1.2 vorhanden und wurde nur einmal in einer Falle mit zwei Haplotypen gefunden und mit einer Häufigkeit von 17,6 % der E2/E3-Reads in dieser Falle nachgewiesen.

Die Sequenzierung des gesamten Genoms und die genomische Epidemiologie werden zunehmend eingesetzt, um die Virusvielfalt während einer Epidemie oder eines Ausbruchs zu verstehen. Mit der Fähigkeit, kleinere Varianten zu erkennen und diese Varianten zeitlich und standortübergreifend zu verfolgen, haben sich Genomdaten als nützlich für die Überwachung von Epidemien erwiesen. Die Analyse viraler Genomsequenzen kann zum Verständnis der Ökologie und Übertragung von Viren beitragen [55]. Darüber hinaus können durch die Analyse von Genomsequenzen potenzielle Aminosäure- oder Nukleotidveränderungen identifiziert werden, die sich auf die Virulenz und damit auf die Eignung diagnostischer Tests und Impfstoffe auswirken können [56]. In dieser Studie haben wir eine neuartige bioinformatische Pipeline für RRV entwickelt, ein wichtiges durch Mücken übertragenes Arbovirus in Australien. Diese Pipeline wurde dann verwendet, um eine Sammlung RRV-positiver Homogenate ganzer Mückenfallen zu analysieren, um die räumlich-zeitliche genetische Struktur des Virus im Wellington Shire, Gippsland, Victoria, Australien, zu verstehen. Die MinION-Sequenzierungsplattform von Oxford Nanopore Technologies wurde für diese Studie ausgewählt, da sie längere Sequenzablesungen aus viralen Genomen generieren kann, die eine Analyse im Feinmaßstab und die Auflösung viraler Haplotypen in komplexen Umweltproben ermöglichen [50]. Dies steht im Gegensatz zu Short-Read-Sequenzierungsplattformen wie Illumina, da die Sequenzvielfalt auf die Leselänge beschränkt ist, was die Fähigkeit zur sicheren Beurteilung einzelner individueller Genome und viraler Haplotypen behindert (57).

G4 ist der häufigste zeitgenössische Genotyp von RRV in Australien [17, 19, 58]. G4A und G4B wurden beide in Victoria, Queensland und Westaustralien nachgewiesen [19, 59]. In den fünf zuvor analysierten viktorianischen Gesamtgenomsequenzen wurde eine räumliche Häufung festgestellt, wobei G4B nur im Gebiet der Gippsland-Seen und G4A im Landesinneren von Victoria nachgewiesen wurde (59). In dieser Studie unter Verwendung von RAMPART, Amplicon Tiling Amplification und der etablierten Virusverarbeitungspipeline der ARTIC-Gruppe [34] ergab die Analyse der Genomsequenzen von weiteren 20 ganzen Mückenfallen-Grinds, dass G4A in Gippsland Lakes gefunden wird. Dies ist eine interessante Beobachtung, da bis zu dieser Studie nur G4B in Gippsland gesichtet wurde, im Gegensatz zu Westaustralien, wo sowohl G4A als auch G4B seit vielen Jahren in nördlichen, südlichen und zentralen Regionen nachgewiesen wurden [19]. Das offensichtliche Auftreten von G4A in Gippsland in dieser Studie spiegelt möglicherweise eine frühere Unterbeprobung und Generierung von WGS für die nachfolgende Analyse wider.

Das Fehlen einer räumlich-zeitlichen Virusstruktur von RRV im Gebiet der Gippsland-Seen und der Nachweis von zehn unterschiedlichen Virus-Haplotypen stehen im Einklang mit heterogenen Viruspopulationen in diesem Gebiet. Der Nachweis einer heterogenen Viruspopulation und das Fehlen einer räumlich-zeitlichen Struktur in der Region der Gippsland-Seen sind nicht überraschend, da viele verschiedene Wirbeltierwirte und Vektorarten an der RRV-Übertragung beteiligt sein können [6, 7, 60] und in denen sie vorkommen das örtliche Wellington Shire [61]. Darüber hinaus bieten die ausgedehnten Salzwiesen-Feuchtgebiete produktive Brutstätten für die Salzwiesenmücken Ae. camptorhynchus und Ae. vigilax, mit gemeldeten Flugreichweiten von 3 [62]–6 km [63] und bis zu 9 km [64] (ohne windunterstützte Ausbreitung).

Eine transovarielle Übertragung von Arboviren (Virusübertragung über Mückeneier) kann häufig bei im Feld gefangenen männlichen Mücken beobachtet werden, die keine Blutmahlzeit zu sich genommen hätten; Daher können diese Mücken das Arbovirus nur direkt von der Mutter erhalten [9]. Dies wurde zuvor bereits für andere Arboviren festgestellt [9] (einschließlich des japanischen Enzephalitis-Virus [65] und des Östlichen Pferdeenzephalitis-Virus [66]) und insbesondere bei Ae beobachtet. Vigilax für RRV [67]. Der wiederholte Nachweis des Haplotyps 2.2 in GB über einen Zeitraum von 9 Monaten (April 2020–Januar 2021) lässt darauf schließen, dass RRV in den Eiern von Mücken überwintert hat [68], da dies unter der gemeldeten Nukleotid-Substationsrate für RRV liegt [19].

Der SNP 9327, der eine Aminosäureveränderung im Haplotyp 1.2 hervorrief, die zu einem Stoppcodon führte, wurde mit einer geringen Häufigkeit von 17,6 % in einer gesamten Trap-Grind-Probe nachgewiesen. Das Auftreten des Stoppcodons (SNP 9327) in einer gemischten Haplotyp-Probe war unerwartet. Allerdings wurden bereits Berichte über verkürzte Proteine ​​und Stoppcodons in Strukturproteinen beschrieben [69, 70]. Konkret führte eine Frameshift-Mutation im S1-Gen des SARS-CoV-2-Spike-Proteins zu einem verkürzten S1-Protein in einem geringen Prozentsatz. Da es einen großen Prozentsatz vollständig ausgebildeter S-Proteine ​​gab, wurde die Hypothese aufgestellt, dass funktionelles und verfügbares S1-Protein von den funktionierenden Viren im viralen Quasispezies-Schwarm erworben werden würde [69]. Ein ähnliches Stoppcodon wurde im nsP3-Protein des O'nyong'nyong-Virus entdeckt, einem RRV-ähnlichen Alphavirus, und es wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Vorhandensein des Stoppcodons die Infektiosität des Virus im Anopheles gamdiae-Wirtsvektor verändert hat [70].

Bei Verwendung von RAMPART und InterARTIC werden nur der Genotyp und die gesamte Genomsequenz identifiziert. Um die Analyse des viralen Haplotyps zu erleichtern, mussten kleinere SNPs im Feinmaßstab verwendet werden, die Quasispezies über einem Schwellenwert von 3 % der Lesevorgänge mit einem alternativen Nukleotid zur Referenz darstellen. In dieser Studie haben wir eine neuartige bioinformatische Pipeline entwickelt, die iVar [50] und die visuelle Bewertung einzelner verknüpfter SNPs in der E2/E3-Region verwendet, um die Variation innerhalb des Wirts zu messen.

SNP-Analyseprogramme wie BCFtools call [38], LoFreq [71], FreeBayers [72], WhatsHap [73, 74], VirStrain, HaploFlow, HaploClique, Shorah, nanopolish [75] usw. wurden als nicht geeignet für die Analyse erachtet Analyse, da sie einen Schwellenwert anwenden, der zu hoch ist, um kleinere Allele zu erkennen, und stattdessen einen Konsens aus der Falle und nicht die repräsentativen Genomsequenzen innerhalb des Virusschwarms melden.

Die in diesem Assay entwickelten Vollgenom-Primer deckten nur das CDS von RRV ab. Der Ausschluss der 3‘- und 5‘-UTRs kann dazu führen, dass Mutationen im Virus übersehen werden, und dies stellt eine Einschränkung der Studie dar.

Mit der Fähigkeit, kleinere Allele aus Mückenpopulationen zu erkennen, kann ein umfassenderes Bild der zirkulierenden RRV-Stämme gewonnen werden. Eine verstärkte Überwachung könnte die Ausbreitung bestimmter viraler Haplotypen aufzeigen und dazu dienen, die Populationsgröße innerhalb einer bestimmten Saison zu verstehen. Die hier entwickelten Methoden könnten auch auf andere durch Mücken übertragene Arboviren von Bedeutung für die öffentliche Gesundheit angewendet werden.

Die aus dieser Studie generierten Datensätze sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Aedes

Komplementäre Desoxyribonukleinsäure

Codierungssequenz

Zyklusschwelle

Culex

Doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure

Hüllprotein 2/3

Golden Beach, Wellington, Victoria

Grafische Benutzeroberfläche

Holland's Landing, Wellington, Victoria

Geißblätter, Wellington, Victoria

Loch Sport, Wellington, Victoria

Marley Point, Wellington, Victoria

Polymerase Kettenreaktion

Lesen Sie Zuordnung, Kartierung und phylogenetische Analyse in Echtzeit

Ribonukleinsäure

Ross-River-Virus

Quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion

Einzelnukleotidpolymorphismus

Nicht übersetzte Region

Sequenzierung des gesamten Genoms

Woodpile, Wellington, Victoria

Flaxman JP, Smith DW, Mackenzie JS, Fraser JRE, Bass SP, Hueston L, et al. Ein Vergleich der durch das Ross-River-Virus und das Barmah-Forest-Virus verursachten Krankheiten. Med J Aust. 1998;169:159–63.

Artikel Google Scholar

El-Hage CM, Bamford NJ, Gilkerson JR, Lynch SE. Ross-River-Virus-Infektion bei Pferden: Bewertung der ökologischen und klinischen Folgen. J Pferdetierarzt. 2020;93:103143.

Artikel Google Scholar

Mackenzie JS, Lindsay MD, Coelen RJ, Broom AK, Hall RA, Smith DW. Arboviren, die in der zoogeografischen Region Australasien Krankheiten beim Menschen verursachen. Arch Virol. 1994;136:447–67.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Russell RC. Ross-River-Virus: Ökologie und Verbreitung. Annu Rev Entomol. 2002;47:1–31.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Claflin SB, Webb CE. Ross-River-Virus: Viele Vektoren und ungewöhnliche Wirte sorgen für einen unberechenbaren Erreger. PLoS Pathog. 2015;11:e1005070.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Stephenson EB, Peel AJ, Reid SA, Jansen CC, McCallum H. Die nichtmenschlichen Reservoire des Ross-River-Virus: eine systematische Überprüfung der Beweise. Parasitenvektoren. 2018;11:188.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Harley D, Sleigh A, Ritchie S. Übertragung, Infektion und Krankheit des Ross-River-Virus: eine interdisziplinäre Übersicht. Clin Microbiol Rev. 2001;14:909–32.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watts DM, Eldridge BF. Transovarielle Übertragung von Arboviren durch Mücken: eine Übersicht. Med. Biol. 1975;53:271–8.

CAS PubMed Google Scholar

Turell MJ. Horizontale und vertikale Übertragung von Viren durch Insekten- und Zeckenvektoren. In: Die Arboviren: Epidemiologie und Ökologie. Boca Raton: CRC Press; 2020. S. 127–52.

Kapitel Google Scholar

Weaver SC. Urbanisierung und geografische Ausbreitung zoonotischer arboviraler Erkrankungen: Mechanismen und mögliche Strategien zur Prävention. Trends Mikrobiol. 2013;21:360–3.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Weaver SC, Charlier C, Vasilakis N, Lecuit M. Zika, Chikungunya und andere neu auftretende, durch Vektoren übertragene Viruserkrankungen. Annu Rev Med. 2018;69:395–408.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Weaver SC, Reisen WK. Gegenwärtige und zukünftige Bedrohungen durch Arboviren. Antivirale Res. 2010;85:328–45.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Damtew YT, Tong M, Varghese BM, Hansen A, Liu J, Dear K, et al. Zusammenhänge zwischen Temperatur und Ross-River-Virusinfektion: eine systematische Überprüfung und Metaanalyse epidemiologischer Beweise. Acta Trop. 2022;231:106454.

Artikel PubMed Google Scholar

Colón-González FJ, Sewe MO, Tompkins AM, Sjödin H, Casallas A, Rocklöv J, et al. Prognose des Risikos von durch Mücken übertragenen Krankheiten in einer wärmeren und bevölkerungsreicheren Welt: eine Modellstudie mit mehreren Modellen und mehreren Szenarien. Lancet Planet Health. 2021;5:e404–14.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Rochlin I, Faraji A, Ninivaggi DV, Barker CM, Kilpatrick AM. Anthropogene Auswirkungen auf Mückenpopulationen in Nordamerika im letzten Jahrhundert. Nat Commun. 2016;7:13604–13604.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Doherty R, Whitehead R, Gorman B, O'gower A. Die Isolierung eines dritten Arbovirus der Gruppe A in Australien, mit vorläufigen Beobachtungen zu seiner Beziehung zur epidemischen Polyarthritis. Aust J Sci. 1963;26:183–4.

Google Scholar

Michie A, Mackenzie JS, Smith DW, Imrie A. Die Genomsequenzanalyse des ersten Ross-River-Virus-Isolats aus Papua-Neuguinea weist auf eine langfristige, lokale Evolution hin. Viren. 2021;13:482.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu W, Kizu JR, Le Grand LR, Moller CG, Carthew TL, Mitchell IR, et al. Lokalisierte Ausbrüche epidemischer Polyarthritis bei Militärangehörigen, verursacht durch verschiedene Unterlinien des Ross-River-Virus, Nordostaustralien, 2016–2017. Emerg Infect Dis. 2019;25:1793.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Michie A, Dhanasekaran V, Lindsay MDA, Neville PJ, Nicholson J, Jardine A, et al. Die Phylogenie- und Evolutionsanalyse des Ross-River-Virus im Genommaßstab zeigt periodische Schwankungen der Abstammungsdominanz in Westaustralien, 1977–2014. J Virol. 2020;94:e01234-01219.

Artikel Google Scholar

Duffy S. Warum sind die Mutationsraten des RNA-Virus so verdammt hoch? PLoS Biol. 2018;16:e3000003.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Holland J, Spindler K, Horodyski F, Grabau E, Nichol S, VandePol S. Schnelle Evolution von RNA-Genomen. Wissenschaft. 1982;215:1577–85.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sanjuán R, Domingo-Calap P. Mechanismen der Virusmutation. Cell Mol Life Sci. 2016;73:4433–48.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Holmes EC. Die Entwicklung der Virusentstehung. Proc Natl Acad Sci. 2006;103:4803–4.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Domingo EJJH, Holland JJ. RNA-Virusmutationen und Überlebensfähigkeit. Annu Rev Microbiol. 1997;51:151.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jaimes JA, Millet JK, Stout AE, André NM, Whittaker GR. Eine Geschichte von zwei Viren: den unterschiedlichen Spike-Glykoproteinen feliner Coronaviren. Viren. 2020;12:83.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ou X, Liu Y, Lei X, Li P, Mi D, Ren L, et al. Charakterisierung des Spike-Glykoproteins von SARS-CoV-2 beim Viruseintritt und seiner immunologischen Kreuzreaktivität mit SARS-CoV. Nat Commun. 2020;11:1–12.

Artikel Google Scholar

Liu WJ, Rourke MF, Holmes EC, Aaskov JG. Persistenz mehrerer genetischer Abstammungslinien innerhalb der Intrahost-Populationen des Ross-River-Virus. J Virol. 2011;85:5674–8.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Faragher SG, Meek ADJ, Rice CM, Dalgarno L. Genomsequenzen eines maus-avirulenten und eines maus-virulenten Stamms des Ross-River-Virus. Virologie. 1988;163:509–26.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rückert C, Ebel GD. Wie führen Virus-Mücken-Interaktionen zur Virusentstehung? Trends Parasitol. 2018;34:310–21.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Quick J, Grubaugh ND, Pullan ST, Claro IM, Smith AD, Gangavarapu K, et al. Multiplex-PCR-Methode für die MinION- und Illumina-Sequenzierung von Zika- und anderen Virusgenomen direkt aus klinischen Proben. Nat-Protokoll. 2017;12:1261.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Quick J, Loman NJ, Duraffour S, Simpson JT, Severi E, Cowley L, et al. Tragbare Genomsequenzierung in Echtzeit zur Ebola-Überwachung. Natur. 2016;530:228.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shaw AG, Majumdar M, Troman C, O'Toole Á, Benny B, Abraham D, et al. Schneller und empfindlicher direkter Nachweis und Identifizierung von Polioviren aus Stuhl- und Umweltüberwachungsproben mittels Nanoporensequenzierung. J Clin Microbiol. 2020;58:e00920-00920.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tyson JR, James P, Stoddart D, Sparks N, Wickenhagen A, Hall G, et al. Verbesserungen der ARTIC-Multiplex-PCR-Methode zur SARS-CoV-2-Genomsequenzierung mithilfe von Nanoporen. bioRxiv. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.09.04.283077.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

WALL. https://artic.network/rampart, https://github.com/artic-network/rampart.

Li H. Minimap2: Paarweise Ausrichtung für Nukleotidsequenzen. Bioinformatik. 2018;34:3094–100.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wick RR, Judd LM, Gorrie CL, Holt KE. Vervollständigung der Assemblierung des Bakteriengenoms mit Multiplex-MinION-Sequenzierung. Mikrobielle Genomik. 2017;3:e000132.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferguson JM, Gamaarachchi H, Nguyen T, Gollon A, Tong S, Aquilina-Reid C, et al. InterARTIC: eine interaktive Webanwendung für die Analyse der gesamten Genom-Nanoporensequenzierung von SARS-CoV-2 und anderen Viren. Bioinformatik. 2022;38(5):1443–6.

Danecek P, Bonfield JK, Liddle J, Marshall J, Ohan V, Pollard MO, et al. Zwölf Jahre SAMtools und BCFtools. Gigawissenschaft. 2021;10:giab008.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Oxford Nanopore Technologies Medaka. https://github.com/nanoporetech/medaka.

Loman NJ, Quick J, Simpson JT. Ein vollständiges Bakteriengenom, das de novo ausschließlich unter Verwendung von Nanoporen-Sequenzierungsdaten zusammengesetzt wurde. Nat-Methoden. 2015;12:733–5.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Batovska J, Blacket MJ, Brown K, Lynch SE. Molekulare Identifizierung von Mücken (Diptera: Culicidae) im Südosten Australiens. Ecol Evol. 2016;6:3001–11.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Batovska J, Mee PT, Lynch SE, Sawbridge TI, Rodoni BC. Sensitivität und Spezifität der Metatranskriptomik als Instrument zur Arbovirus-Überwachung. Sci Rep. 2019;9:19398.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Batovska J, Lynch SE, Rodoni BC, Sawbridge TI, Cogan NOI. Metagenomischer Arbovirus-Nachweis mittels MinION-Nanoporensequenzierung. J Virol-Methoden. Rev. 2017;249:79–84.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hall RA, Prow NA, Pyke AT. Ross-River-Virus. In: Liu D, Herausgeber. Molekularer Nachweis menschlicher viraler Krankheitserreger. Boca Raton: CRC Press; 2011.

Google Scholar

nCoV-2019-Sequenzierungsprotokoll v2 (GunIt) V.2. https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v2-bdp7i5rn?step=18.3&comment_id=88097&version_warning=no, https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing -protocol-v3-locost-bh42j8ye?step=11.4.

Freed NE, Vlková M, Faisal MB, Silander OK. Schnelle und kostengünstige Sequenzierung des gesamten Genoms von SARS-CoV-2 mithilfe von 1200-bp-Kachelamplikons und Oxford Nanopore Rapid Barcoding. Biol-Methodenprotokolle. 2020;5:bpaa014.

Artikel Google Scholar

nCoV-2019-Sequenzierungsprotokoll v3 (LoCost) V.3. https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye?step=11.4.

Tamura K, Stecher G, Kumar S. MEGA11: Molekulare Evolutionsgenetische Analyse Version 11. Mol Biol Evol. 2021;38:3022–7.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Katoh K, Misawa K, Kuma K, Miyata T. MAFFT: eine neuartige Methode zur schnellen Ausrichtung mehrerer Sequenzen basierend auf der schnellen Fourier-Transformation. Nukleinsäuren Res. 2002;30:3059–66.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Grubaugh ND, Gangavarapu K, Quick J, Matteson NL, De Jesus JG, Main BJ, et al. Ein Amplikon-basiertes Sequenzierungs-Framework zur genauen Messung der Virusvielfalt innerhalb des Wirts mithilfe von PrimalSeq und iVar. Genombiol. 2019;20:8.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Wenger AM, Zehir A, Mesirov JP. Variantenüberprüfung mit dem integrativen Genomik-Viewer. Krebs Res. 2017;77:e31–4.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Robinson JT, Thorvaldsdóttir H, Winckler W, Guttman M, Lander ES, Getz G, et al. Integrativer Genomik-Viewer. Nat Biotechnol. 2011;29:24–6.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thorvaldsdóttir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): Hochleistungsvisualisierung und -exploration von Genomdaten. Kurzes Bioinform. 2012;14:178–92.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Milne I, Stephen G, Bayer M, Cock PJA, Pritchard L, Cardle L, et al. Verwendung eines Tablets zur visuellen Untersuchung von Sequenzierungsdaten der zweiten Generation. Kurzes Bioinform. 2012;14:193–202.

Artikel PubMed Google Scholar

Frank SA, Bush RM. Hindernisse für das Entweichen von Antigenen durch Krankheitserreger: Kompromiss zwischen Reproduktionsrate und Antigenveränderlichkeit. BMC Evol Biol. 2007;7:229.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

DeFilippis VR, Villarreal LP: 4 – Eine Einführung in die Evolutionsökologie der Eiruses. In: Virale Ökologie. Herausgegeben von Hurst CJ, Academic Press; 2000: 125-208.

Schrinner SD, Mari RS, Ebler J, Rautiainen M, Seillier L, Reimer JJ, et al. Haplotyp-Threading: Präzise polyploide Phaseneinteilung aus langen Lesevorgängen. Genombiol. 2020;21:252.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Michie A, Ernst T, Chua I, Joanna L, Lindsay MD, Neville PJ, et al. Phylogenetische und zeitliche Analyse des Barmah-Waldvirus, abgeleitet aus der Genomsequenzanalyse. Viren. 2020;12:732.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Batovska J, Mee PT, Sawbridge TI, Rodoni BC, Lynch SE. Verbesserte Arbovirus-Überwachung mit metatranskriptomischer Hochdurchsatzverarbeitung von im Feld gesammelten Mücken. Viren. 2022;14:2759.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koolhof IS, Gibney KB, Bettiol S, Charleston M, Wiethoelter A, Arnold AL, et al. Die Vorhersage dynamischer Ausbrüche des Ross-River-Virus: Victoria, Australien. Epidemien. 2020;30:100377.

Artikel PubMed Google Scholar

Campbell J, Aldred J, Davis G. Einige Aspekte der Naturgeschichte des Ross-River-Virus im Südosten von Gippsland, Victoria. In: Arbovirus-Forschung in Australien, Tagungsband fünftes Symposium, 28. August–1. September 1989. Brisbane: CSIRO-Abteilung für tropische Tierproduktion; 1989. S. 24–28.

Porter A, Holland M. Eine Studie über die Flugreichweite von Aedes camptorhynchus Thompson (Diptera: Culicidae) in der East Gippsland Region, Victoria, Australien. Bull Aust Mosq Control Assoc. 1992;3:13–6.

Google Scholar

Robertson J. Biologie der Ross-River-Virus-Überträgermücke Ochlerotatus camptorhynchus in einer städtischen Umgebung. Perth: University of Western Australia; 2006.

Google Scholar

Chapman HF, Hughes JM, Jennings C, Kay BH, Ritchie SA. Populationsstruktur und Verbreitung der Salzwiesenmücke Aedes vigilax in Queensland, Australien. Med Vet Entomol. 1999;13:423–30.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rosen L, Tesh RB, Lien JC, Cross JH. Transovarielle Übertragung des japanischen Enzephalitis-Virus durch Mücken. Wissenschaft. 1978;199:909–11.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Morris CD, Srihongse S. Eine Bewertung der Hypothese der transovariellen Übertragung des Östlichen Pferdeenzephalomyelitis-Virus durch Culiseta melanura. Bin J Trop Med Hyg. 1978;27:1246–50.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kay BH. Drei Arten der Übertragung des Ross-River-Virus durch Aedes vigilax (Skuse). Aust J Exp Biol Med Sci. 1982;60:339–44.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bader CA, Williams CR. Eier der australischen Salzwiesenmücke Aedes camptorhynchus überleben lange Zeit und schlüpfen in Raten: Auswirkungen auf die Biosicherheit in Neuseeland. Med Vet Entomol. 2011;25:70–6.

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Andrés C, Garcia-Cehic D, Gregori J, Piñana M, Rodriguez-Frias F, Guerrero-Murillo M, et al. Natürlich vorkommende SARS-CoV-2-Gendeletionen in der Nähe der Spike-S1/S2-Spaltungsstelle in der viralen Quasispezies von COVID19-Patienten. Neu auftretende Mikroben infizieren. 2020;9:1900–11.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Götte B, Liu L, McInerney GM. Das rätselhafte Alphavirus-Nichtstrukturprotein 3 (nsP3) enthüllt endlich seine Geheimnisse. Viren. 2018;10:105.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilm A, Aw PP, Bertrand D, Yeo GH, Ong SH, Wong CH, et al. LoFreq: ein sequenzqualitätsbewusster, hochempfindlicher Variantenaufrufer zum Aufdecken der Heterogenität von Zellpopulationen aus Hochdurchsatz-Sequenzierungsdatensätzen. Nukleinsäuren Res. 2012;40:11189–201.

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Garrison E, Marth G. Haplotyp-basierte Variantenerkennung durch Short-Read-Sequenzierung. arXiv-Vorabdruck arXiv:1207.3907. 2012.

Ebler J, Haukness M, Pesout T, Marschall T, Paten B. Haplotyp-bewusstes Diplotyping aus lauten langen Lesevorgängen. Genombiologie. 2019;20(1):116. https://doi.org/10.1186/s13059-019-1709-0.

Martin M, Patterson M, Garg S, O Fischer S, Pisanti N, Klau GW, et al. WhatsHap: schnelle und genaue lesebasierte Phaseneinstellung. bioRxiv-Vorabdruck. https://doi.org/10.1101/085050.2016:085050.

Wick RR, Judd LM, Holt KE. Leistung von Basecalling-Tools für neuronale Netzwerke für die Oxford-Nanopore-Sequenzierung. Genombiol. 2019;20:129.

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

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Die Autoren danken James Ferguson für die Erstellung von InterARTIC und die Unterstützung bei der Nutzung des Programms. Die Autoren möchten sich auch bei Nikki Freed für ihre Unterstützung bei der Optimierung des hier aufgeführten Nasslabor-Kachelgrundierungsansatzes bedanken. Abschließend danken wir den Gutachtern und Herausgebern für die Zeit, die sie sich für die Bearbeitung dieses Artikels genommen haben.

EDV wird durch ein Forschungsstipendium der australischen Regierung unterstützt, das vom Verteidigungsministerium bereitgestellt wird; Defence, Science and Technology Group, Agriculture Victoria und La Trobe University und wird außerdem durch einen zusätzlichen Zuschuss (ID: G12017SRodoniLaT459) vom Defence Science Institute unterstützt.

Landwirtschaft Victoria, AgriBio, Zentrum für Agrarbiowissenschaften, Bundoora, VIC, 3083, Australien

Ellen M. de Vries, Noel OI Cogan, Brendan C. Rodoni und Stacey E. Lynch

School of Applied Systems Biology, La Trobe University, Bundoora, VIC, 3083, Australien

Ellen M. de Vries, Noel OI Cogan und Brendan C. Rodoni

Abteilung für Sensoren und Effektoren, Defence Science & Technology Group, Fishermans Bend, VIC, 3207, Australien

Aneta J. Gubala

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EDV führte die gesamte Analyse und technische Arbeit durch und erstellte den ersten Entwurf des Manuskripts. NOIC, AG, BCR und SEL trugen alle zur Entwicklung der hier vorgestellten Ideen bei, halfen beim Schreiben und Bearbeiten des Manuskripts und überwachten das Projekt. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ellen M. de Vries.

Unzutreffend.

Unzutreffend.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Artbildung von Mücken aus Probenfallen. Tabellarische Daten aller Mückenarten und -zahlen, die in den für die RRV-Sequenzierung verwendeten Fallen nachgewiesen wurden. Es werden nur Fallen angezeigt, für die zutreffende Daten vorhanden waren.

RRV-Genome, die zur Erzeugung eines vollständigen Genoms zur Standardisierung verwendet werden; 123 RRV-Gesamtgenomsequenzen werden verwendet, um eine einzelne Konsensdatei zu erstellen, um alle generierten RRV-Gesamtgenomsequenzen dagegen zu standardisieren. Alle Sequenzen sind mit ihrer Zugangsnummer aufgeführt und wurden von NCBI heruntergeladen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

de Vries, EM, Cogan, NOI, Gubala, AJ et al. Genomische Verfolgung des Ross-River-Virus im Feinmaßstab mittels Nanoporensequenzierung. Parasites Vectors 16, 186 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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Eingegangen: 29. November 2022

Angenommen: 11. März 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05734-z

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